DNA – to absolute molecular numbers in the dye

The principle of lbFCS

In this study, in the targets of the molecular counting model for DNA dyeing, we used a DNA duplication (30) method that allows precise and large-scale production of artificial nanostructures from DNA as a building material. In the context of DNA dyeing, DNA duplication has been widely used to create DS nanometer templates as an ideal orientation system to obtain the spatial resolution of a microscope. (6,32,33) In the following, we will show how to calculate the number of DSs on the origami structures of DNA in DNA image images with lbFCS (step-by-step descriptions of all the analyzes can be found in Supplemental Figure 1). Figure 1a shows the DNA-dye scheme of two superficial immobilized DNA-orgia, one with two DSs (N = 2) and the other one is DS (N = 1). Freely diffused images are associated with DS association rates K.on Distance from distribution rate K.Off, Thereby generating the characteristic blinking required for lower level SMLM reconstruction. The concentration of the image fibers is denoted as C. DNA dye tomography was performed using an individually constructed internal reflection fluorescence (TIRF) microscope with a homogeneous ("flat top") intensity profile for optimized acquisition conditions (25) and temperature control (see Supplementary Figure 2a for details). Low laser energy was chosen to obtain image spacing rates that were unbiased by photolabs (Supplemental Figure 2b), while maintaining the ability to detect solid spots. Although reducing the laser energy will minimize the damage to the photoconductors, it is caused by a decrease in spatial resolution, which will result in localization clusters, which does not allow the number of DSs to be counted. (Figure 1b). However, lbFCS allows to calculate the number of DSs for each structure solely on the assumption that (1) all target structures in the sample are subjected to the same image concentration. C And (2) all individual DSs of the target structures bind image filaments with equal hybridization rates K.on And K.Off. It implies values K.on And K.Off Defined for all samples by a single sample (e.g., globally) with DS and consistent design sequence for a fixed set of environmental conditions (temperature, buffer, etc.). Each automatically detected clusters I In the picture we define a circular region called a "choice" (white circles in Fig. 1b) for which we plot the corresponding intensity and time. II(T) Contains temporal information about the image associated with a specific target structure (Figure 1c, top). From here, we then calculate the autocorrelation curves CI(L) (Figure 1c, bottom), a well-described monoexportant fit model previously obtained for surface-integrated (SI) -FCS: (31,34,35)CI(L) = AIEL/ tI + 1. Here, L Is defined as the autocorrelation load time, AI As the amplitude of the autocorrelation function at zero lag CI(L = 0) and τI As a characteristic of the exponential decay constant. After previous derivations, (31,34,35) the model parameters are given as(1)And(2)Based on the previous assumptions of global hybridization rates and image concentration, it is easy to see that τI Is only a function of global rate constants K.on And K.Off Which means that all of the sampling concentrations of the image are selected C Must yield the same value τI Within the ambiguity of measurement. As a result, the average value ⟩τ p at all peaks is sufficient to obtain rate constants. Amplitude AI In contrast, it is subject to the same global parameters but additionally dependent on the number of DSs NI In each pictogram. lbFCS makes use of these dependencies to remove constant constants of hybridization speed K.on And K.Off And the number of DSs NI In each choice according to the following procedure. First, we make and draw a DNA sample of DNA (here's an example that contains both) N = 1 and N = 2 DNA Orgasm Structure) At Three Different Image Concentrations (C1C2C3) And automatically identify all clusters with three resulting SR images (see Supplemental Figure 1). Next, we coordinate all intensities and remove clusters that are characterized by unrepresentative binding and / or binding dynamics, which is characterized by distinct monoexisting action at the filtering stage, prior to further analysis (see Supplemental Figure 3). The left panel in 1d shows the result τI Histograms from all other clusters in the three images. As we expected from eq 2, we find that the distribution shift to lower values ​​increases C Corresponding to the reduction of the mean. After the above justification, the mean value of the concentration of each image ⟩⟨⟩ C (Figure 1d, right panel) gives the global course constancy K.on And K.Off eq 2. 2. A similar approach was previously demonstrated using SI-FCS for the same system (ie, DNA dye immobilized on the surface of the DNA) by ensemble autocorrelation analysis to develop integrated autocorrelation analysis over larger masses of camera pixels. Thousands of DNA originating from the original), which made it possible to obtain image hybridization rates through a series of concentrations. (31) Here, we show that this approach can be directly transferred to each localization cluster by DNA spin resolution. . This allows them to be able to use amplitude further AI Each choice for molecular counting. According to Eq 1, AI This depends on the number of DSs in each cluster, resulting in a distribution at two peaks (or for DNA orgia). N = 1 or N = 2) In addition, the concentration-dependent shift appears in the left panel of Figure 1. Each AI The cost can go up NI By reforming from Eq 1 (Figure 1e, right) and insert the available speed constants now K.on And K.Off Together with the corresponding image concentration C For each measurement. Figure 1e, right, shows the distribution of the number of DSs in each localization cluster (e.g., one or two DSs).

Figure 1

Figure 1. Absolute molecular counting principle with lbFCS. (A) DNA dye scheme, a DNA diagram of nanostructured images showing a variable number of dock bones (DS) N (Or N = 1 or N = 2). (B) DNA dye obtained at low laser energy from two DNA dyes (a). Spatial resolution is not enough to clearly distinguish the number of DSs NI In the picture of the DNA image. All image localization clusters are automatically identified as circular "peaks" (white circles) for the DS counting analysis below. (C) Advanced: For each pictogram, saturation vs. time, containing temporal information on the binding and linking of the image, is calculated by the autocorrelation function. Bottom: The autocorrelation curve calculated by the intensity trace shows the characteristic mono-export decay and the amplitude of the two parameters of the fit model is well described. AI And the characteristic dissolution time τI (Eqs. 1 and 2). D) Obtain DNA hybridization rates by means of a series of image concentrations. Left: Histograms τI Distribution of all identified localization clusters (going through the filtering procedure as in Supplemental Figure 3) in the same target DNA – image images, measured at three different image concentrations C. The mean ⟨τ⟩ (black rash lines) decreases CAs expected from eq 2. To the right: Weapon eq 2 to ⟨τ⟨ C Income K.on And K.Off. (E) Left: distribution AI Obtained from the same clusters as in histograms (d). Right: Reforming and Inserting EQ 1 (K.on, K.Off, C) Allows to transform each of them AI To the number of DSs NI In each cluster, you pick all the samples N = 1 and N = 2 (black rash lines). Scale bars: 50 nm (b). The error bars correspond to the standard deviation.

LbFCS Confirmation

In order to demonstrate the ability of lbFCS to extract DNA hybridization rates and in low-energy DNA dye images obtained by counting DSs, we first investigated a DNA origami design case involving only one DS (N = 1, referred to as "1DS"), as depicted in Fig. 2a, as this is the only case that implies the truth of the computations. In 10 repetitions of the same experiment, for 2 months, we prepared pure image stock at 5, 10, and 20 nm for low laser energy capture on 1DS samples (10 × 3 samples, standard conditions: image buffer containing 10 mm). MgCl2 And temperature is controlled at 23 ± 0.1 ° C). LbFCS analysis of localization clusters showed good reproducibility with respect to output parametersI And AI (Figure 2b, c). The mean (error line, standard deviation) is denoted τ ⟨⟨⟩⟩ τ τ τI Distribution and mean (error line, intercostal range) are denoted A that AI Distribution (N And NI) Is displayed when the ensemble statistic is represented. Representation 1 /A In Figure 2c it is chosen to verify the linear dependence C (See eq 1). In addition, the plot serves as a check on whether the image concentration is corrected in the correct ratio when fitting eq 1 Sec– Origin. Fig. 2d shows the scatterer K.on And K.Off Depending on the job of 2b 2b. Based on all measurements, we obtained the mean hybridization rate ⟨K.on= (6.5 ± 0.3) × 106 M–1 S–1 And ⟨K.Off= (2.66 ± 0.05) × 10–1 S–1 Standard deviations below 5% and 2%, respectively, with the approval of high reproducibility. We attribute this high accuracy to the fact that we can minimize non-specific binding effects on the surface (Supplemental Figure 4) only by analyzing detected clusters that have also passed the filter criteria (see Supplemental Figure 3). Next, the values ​​(K.on, K.Off) For each stock, the number of DSs in each of the three samples in the respective concentration series was used. Figure 2e shows the histogram NI There are more than 30 samples (> 90% of all data points belong) x– No restrictions; > 97k localization clusters) with median at N = 0.97 ± 0.11, which is in good agreement with the original design of 1DS structures.

Figure 2

Figure 2. Experimental verification of lbFCS. (ა) 1DS სტრუქტურები = 1 lbFCS მიდგომის შესამოწმებლად. (ბ) 10 კონცენტრაციის სერიის განმეორება, თითოეულში ახლად მომზადებული გამოსახულების აქციების (10 × 3 ნიმუში). ⟩Τ⟩ წინააღმდეგ შესაფერისია თითოეული კონცენტრაციის სერიისათვის, რაც მაღალი რეპროდუქციულობის მაჩვენებელია. (გ) 1 / წინააღმდეგ მსგავსი რეპროდუქციულობა აჩვენებს. წარმოშობის დროს გადასასვლელი ჯდება, რომ კონცენტრაციის კოეფიციენტები სწორად იქნა რეგულირებული. (დ) კომპლექტები on (მარცხენა, ღია მწვანე) და გამორთულია (სწორი, მუქი მწვანე) ამონაწერი მოყვანილი პუნქტიდან (ბ) თითოეული გამოსახულების საფონისა. საშუალო და სტანდარტული გადახრა მოცემულია, როგორც ნაცრისფერი ხაზისა და ღია ნაცრისფერი ფართობის შესაბამისად. (e) lbFCS დათვლის შედეგების ჰისტოგრამა კონცენტრაციის სერიის ყველა 30 ნიმუშზე 1DS სტრუქტურებზე. შავი დატეხილი ხაზი მიუთითებს საშუალოზე at = 0.97 ± 0.11. შეცდომის ბარები შეესაბამება სტანდარტულ გადახრას ⟨τ⟨ შემთხვევაში, on, და გამორთულია და ინტერკარტილური დიაპაზონი 1 / შემთხვევაში.

LbFCS– ის დათვლის უნარი დაფუძნებულია ვარაუდზე on და გამორთულია არის გლობალური პარამეტრები, რომლებიც არ იცვლება კონცენტრაციის სერიის გაზომვების დროს. აქედან გამომდინარე, აუცილებელია ზუსტად აკონტროლოთ ექსპერიმენტული პირობები, რომლებიც გავლენას ახდენენ დნმ-ის ჰიბრიდიზაციაზე, როგორიცაა ტემპერატურა და ბუფერული იონის შემადგენლობა. იმისათვის, რომ რაოდენობრივად შევაფასოთ ეს შედეგები, ჩვენ პირველად გავიმეორეთ კონცენტრაციის სერია 1DS ნიმუშებზე 21–24 ° C ტემპერატურაზე (1 ° C მონაკვეთებზე, ყველაფერი 10 მგ MgCl– ზე)2), ტემპერატურის დიაპაზონი, რომელიც ჩვენ ვიხილეთ კომერციული მიკროსკოპის ხშირად ჩაკეტილი ნიმუშის სივრცის გათბობის გამო, ვიზუალიზაციის დროს. როგორც ადრე დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის ბევრ კვლევაში იყო ნათქვამი, (32,36−38) გრაფიკი 3a გვიჩვენებს, რომ დისოციაციის სიჩქარე მნიშვნელოვნად იცვლება (მდე .5 2,5-ჯერ) ამ ტემპერატურულ დიაპაზონში, მაშინ როდესაც ასოციაციის მაჩვენებლები არ იცვლება გაზომვის შეცდომისა და თვალსაჩინო ტენდენცია არ არის ჩვენ ასევე შეცვალეთ იონის კომპოზიცია 10 მკგ MgCl სტანდარტის შეცვლით2 m 5 მმ-ით (23 ° C ტემპერატურაზე) და კვლავ გამოიყენა lbFCS მონიტორინგზე გავლენის მისაღწევად ორივე კურსიზე, მაგალითად, 3-ჯერ გაზრდაზე on 5-დან 10 მმ-მდე (სურათი 3 ბ). ამასთან, სანამ ტარიფები შენარჩუნებულია კონცენტრაციის სამივე გაზომვაში, lbFCS იძლევა დათვლის სწორ შედეგს მე = 1, ფაქტობრივი ტემპერატურის ან იონური შემადგენლობისგან დამოუკიდებელი (დამატებითი სურათი 5). დაბოლოს, უნდა დაისვას საკითხი, თუ რამდენად ზუსტად უნდა იყოს კონტროლირებადი აბსოლუტური გამოსახულების კონცენტრაცია. დანამატის გრაფიკი 6-ში, ჩვენ გადააკეთეთ ერთი საფონდო გაზომვის სერია სტანდარტული პირობებით, როგორც ეს მოცემულია ნახაზზე 1 ბ – ე, კონცენტრაციის სწორი კოეფიციენტების შენარჩუნებისას განზრახ ჩათვლით უფრო მაღალი ან დაბალი აბსოლუტური გამოსახულების კონცენტრაციების გათვალისწინებით. შედეგები ნათლად აჩვენებს, რომ არასწორი აბსოლუტური გამოსახულების კონცენტრაცია არც გავლენას ახდენს lbFCS- ის აბსოლუტურ დათვლის უნარზე და არც დიფერენციაციის შედეგზე. გამორთულია სანამ შენარჩუნებულია სწორი კონცენტრაციის კოეფიციენტები (რისთვისაც 1 / fit უზრუნველყოფს კონტროლს წარმოშობის გადაკვეთისას). თუმცა, პროდუქტის გამო on eq 2 -ში, სავარაუდოდ, გამოსახულების კონცენტრაციაა, რომლებიც გადახლართულია "ნამდვილი" მნიშვნელობიდან ფაქტორის ფაქტორის მიხედვით x შედეგად მიღებულ ასოციაციურ მაჩვენებელზე გამრავლდება ინვერსიული ფაქტორი x–1. ამ ორაზროვნების თავიდან ასაცილებლად, იმისათვის, რომ შევადაროთ მიღებული ასოციაციის მაჩვენებლები, ჩვენ ჩავატარეთ საკონტროლო კონცენტრაციის სერია 1DS origamis– ზე, იმავე პირობების სურათის გამოყენებით, სტანდარტულ პირობებში (იხ. სურათი 2 ბ – ე) ყოველი კვლევისთვის.

სურათი 3

სურათი 3. ტემპერატურა და იონური შემადგენლობა, რომელიც გავლენას ახდენს დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის სიჩქარეზე. (ა) lbFCS კონცენტრაციის სერია 1DS სინჯით სხვადასხვა ტემპერატურაზე, რაც ხაზს უსვამს დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის მაჩვენებლების ტემპერატურულ დამოკიდებულებას (ფიქსირდება[MgCl[MgCl[MgCl[MgCl2]= 10 მმ). (ბ) lbFCS კონცენტრაციის სერია 1DS ნიმუშებით სხვადასხვა MgCl2 კონცენტრაციები, რომლებიც გავლენას ახდენს დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის მაჩვენებლებზე (დაფიქსირებული = 23 ° C). რუხი ხაზები და ღია რუხი დაჩრდილული ადგილები შეესაბამება ჰიბრიდიზაციის მაჩვენებლების საშუალო და სტანდარტულ გადახრას, სტანდარტულ პირობებში ( = 23 ° C და[MgCl[MgCl[MgCl[MgCl2]= 10 მმ, იხ. სურათი 2d). შეცდომის ბარები შეესაბამება სტანდარტულ გადახრას ⟨τ⟨ შემთხვევაში, on, და გამორთულია და ინტერკარტილური დიაპაზონი 1 / შემთხვევაში.

მოლეკულური დათვლა

როგორც შემდეგ ნაბიჯს, ჩვენ შეამოწმეთ lbFCS– ის მოქმედება, მტევნების თვითნებურად დაჯგუფებით = 1 მიღებული ადრეული 1DS ექსპერიმენტიდან (მონაცემები აღებული იქნა საფონდო გაზომვებიდან 1-3; იხ. სურათი 2) განსაზღვრული მტევანი > 1 (≡ შიგნით) რაც ტოლია მათი ინტენსივობის მარტივი გამოთქმის დამატებით დროის კვალის წინააღმდეგ (იხ. სურათი 4 ა). ამ გზით, ჩვენ შევქმენით მდე ლოკალიზაციის მტევანი შიგნით = 48 თითოეული გამოსახულების კონცენტრაციისთვის ( = 5, 10 და 20 ნმ) და გააანალიზეს ისინი lbFCS და qPAINT გამოყენებით. ამ ეტაპზე უნდა აღინიშნოს, რომ lbFCS– სგან განსხვავებით, QPAINT– ით DS– ების დათვლას კალიბრირება სჭირდება (23) შემოდინების კურსით. onQPAINT მიღებული მტევნებისგან, რომლებიც შეიცავს მხოლოდ ერთ DS- ს (იხ. დამატებითი სურათი 7 qPAINT მიდგომის პრინციპისთვის). დამატებითი გრაფიკი 8 აჩვენებს შედეგებს, როგორც მოპოვებული სურათი 2b – e 1DS ექსპერიმენტის qPAINT ანალიზით. შემდეგი შედეგები მოლეკულური დათვლისგან qPAINT– დან, შესაბამისად, დამოკიდებულია კალიბრაციის ასოციაციის მაჩვენებელზე onQPAINT = (7.7 ± 0.2) × 106–1–1. შეცდომასთან დაკავშირებით, აქვე გვინდა აღვნიშნოთ onQPAINT ისარგებლებს დანამატის მე -3 დანართში შემავალი ფილტრაციის პროცედურაში, რაც, თავის მხრივ, დაფუძნებულია lbFCS- ის ავტოკორელაციის ანალიზის უნიკალურ მახასიათებლებზე, რათა გამოავლინოს და გამორიცხოს მტევნები, რომლებიც გამოფენენ დინამიკას, რომელიც გამოირჩევა მკაფიო მონოპოლიტიკური ქცევიდან.

სურათი 4

სურათი 4. დოქტორის სტრიქების დათვლა დნმ-ორგამიზე. (ა) ექსპერიმენტული მტევნების 1DS ლოკალიზაციის დაგროვება (აღებულია ფსკერის გაზომვებიდან 1–3, იხ. სურათი 2), DS– ების რაოდენობის გამოთვლებით. შიგნით როგორც ჩანაწერი, რათა დაანგარიშდეს მუშაობის შესრულება. (ბ) დათვლის შედეგის საშუალო გარეთ წინააღმდეგ შიგნით qPAINT– ით მიღებული დაანგარიშების შედეგების შედარება სხვადასხვა გამოსახულების კონცენტრაციებში (წითელი) და lbFCS– ის (ლურჯი) წინააღმდეგ; ნაჩვენებია ყველა გამოსახულების კონცენტრაციაზე (იხ. დამატებითი სურათი 9 ინდივიდუალური lbFCS და qPAINT შედეგებისთვის). შავი დატეხილი ხაზი აჩვენებს ხაზს, რომელიც წარმოიქმნება ფერდობზე ერთი, როგორც მოსალოდნელია იდეალური დათვლის შედეგებისთვის (მაგ. გარეთ = შიგნით). (გ) lbFCS ამონაწერი აქვს ჰიბრიდიზაციის სწორად განაკვეთებს, დამოუკიდებელი გაზომვის დროს შიგნით (on და გამორთულია საშუალებები (ნაცრისფერი ხაზები) და STDs (ღია ნაცრისფერი ადგილები) ნახაზიდან 2d). (დ) ტოპ: დნმ-ორგიამის დიზაინი = 4 DS. იგივე სტრუქტურის სამაგალითო სურათი დაბალი ლაზერული ენერგიის გამოსახულებისგან (მარცხნივ) და მაღალი ლაზერული ენერგიის გამოსახულებით ვიზუალური დათვლისთვის (მარჯვნივ). ქვედა: ვიზუალური დათვლის შედეგები (რუხი), qPAINT (წითელი) და lbFCS (ლურჯი). (ე) იგივე, რაც (დ), მაგრამ = 12 DSs დნმ-ის ორიგამის დიზაინი. ინტენსივობის კვალი, რომელიც აღარ გამოირჩევა ბნელი დროებით (იხ. დანამატი ნახ. 7) შეუძლებელია qPAINT– ის ანალიზით და ჰისტოგრამებში არ არის ნაჩვენები. იხილეთ დამატებითი ცხრილი 1, ჰისტოგრამაზე ანალიზური მტევნების მთლიანი რაოდენობებისთვის. (ვ) იგივე, რაც (დ, ე), მაგრამ = 48 DSs დნმ-ის ორგიამის დიზაინი (ვიზუალური დათვლის ჰისტოგრაფი არ არის ძალიან მჭიდრო DS– ის დაშორების გამო (10 ნმ. მყარი ადგილის გამოვლენის გამო). სასწორი ბარები: 40 ნმმ (ა, დ – ვ). შეცდომა ზოლში (ბ) შეესაბამება ინტერკასტრიულ დიაპაზონს.

სურათი 4b აჩვენებს ანალიზის შედეგებს გარეთ წინააღმდეგ შიგნით ორივე ანალიზის მეთოდისთვის (lbFCS- სთვის გამოსახულია გამოსახულების სამივე კონცენტრაციის ჯამი. იხ. დამატებითი სურათი 9 ა – გ) ინდივიდუალური შედეგების შესახებ = 5, 10 და 20 ნმ, შესაბამისად). როგორც მოსალოდნელი იყო, lbFCS არ აჩვენებს კონცენტრაციულ დამოკიდებულებას და გამოთვლის დათვლის სწორ შედეგებს (გარეთ = შიგნითშავი ხაზის ხაზით მითითებული) მთელ დიაპაზონში შიგნით. ამის საპირისპიროდ, qPAINT იწყებს DS- ების სწორი რაოდენობის შემცირებას გარკვეული მტევანი ზომაზე, ეფექტი დამოკიდებულია გამოსახულების კონცენტრაციაზე (თუმცა = 5 ნმ qPAINT იწყებს ხაზოვანი ურთიერთობისგან გადახრას შიგნით ∼ 48, ამისთვის = 20 ნმ გადახრა უკვე ხდება შიგნით ∼ 12). როგორც დამატებით ფიგურაში 10-ში განმარტა, ეს გამოწვეულია ერთდროულ კასეტში მრავალჯერადი DS– ზე ერთდროული გამოსახულების ერთდროული სავალდებულო შემთხვევის გაზრდის გამო. იმის გამო, რომ qPAINT ალგორითმი ემყარება ბნელი დროების მოპოვებას კასეტური ინტენსივობისგან და კვალის დროის კვალს, მისი შინაგანი ზღვარი, რომელიც მოცემულია გარკვეულ გამოსახულების კონცენტრაციაზე, განისაზღვრება DS- ების მაქსიმალური რაოდენობით თითო კლასტერზე რომლის დროსაც შესაბამისი ინტენსივობის კვალი გამოირჩევა მხოლოდ რამდენიმე და, საბოლოოდ, აღარ არის ბნელი დრო (სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, მუდმივი გამოსახულების ბრუნვის გამო, მტევანი მონაცემების შეძენის დროს მუდმივად ფლუორესირდება). ამ მოსაზრების შესაბამისად, დიაგრამა 4b გვიჩვენებს, რომ რაც უფრო მაღალია გამოსახულების კონცენტრაცია, მით უფრო სწრაფია განსაზღვრული ეს ზღვარი მიღწეულია (იხ. დამატებითი გრაფიკი 9), ბოლო მონაცემების QPAINT მონაცემების წერტილებზე მოპოვებული უნიკალური ბნელი დროების რაოდენობის დეტალური ანალიზისათვის = 5, 10 და 20 ნმ-ზე = 48, 30 და 18, შესაბამისად). ამასთან, უნდა განვიხილოთ, რომ ჩვენი დნმ – საღებავის მონაცემები განასხვავებს მონაცემების ტიპს, რომელიც ადრე ექვემდებარებოდა qPAINT– ის ანალიზს (23) ორი ასპექტით: (i) დაბალი ლაზერის ინტენსივობის გამო, ნათელი დრო უფრო მასშტაბობის ბრძანებაა. (მაგ., არ არის შეზღუდული სწრაფი ფოტოხელოვნებით, როგორც ეს კლასიკური მაღალი რეზოლუციის დნმ-საღებავით) და (ii) ამ კვლევაში გამოყენებული imager-DS თანმიმდევრობის დიზაინს მნიშვნელოვნად აღემატება. onQPAINT (აქ 7.7 × 106–1–1 წინააღმდეგ ადრე (23) 1 × 106–1–1). ამრიგად, ამავდროულად, ჩვენთან ერთდროულად სავალდებულო მოვლენების ალბათობა იზრდება და გამოსახულების კონცენტრაცია (ანუ qPAINT- ის ზღვარი უკვე მიღწეულია ბევრად უფრო მცირე წინა კვლევასთან შედარებით (23).
როდესაც დაადასტურა, რომ lbFCS საშუალებას აძლევს მოლეკულურ დათვლას DS სიმკვრივის ამ ფართო დიაპაზონში, გამოსახულების კონცენტრაციისგან დამოუკიდებლად, ჩვენ შემდეგ გადავამოწმეთ მოსაზრება, რომ lbFCS- ს შეუძლია დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის სწორი მაჩვენებლების ამოღება დამოუკიდებლად . ფიგურა 4c აჩვენებს, რომ ყველასთვის შიგნით ჩვენ მივიღეთ იგივე ჰიბრიდიზაციის მაჩვენებლები გაზომვისას გაურკვევლობაში, EQ 2 და დადასტურდა რომ τმე მართლაც დამოუკიდებელია DS- ების რაოდენობის მიხედვით თითო კლასტერზე.
იმისთვის, რომ სრულად ექსპერიმენტულად გავითვალისწინოთ lbFCS– ის დათვლის შედეგი, ჩვენ შევიმუშავეთ დნმ-ორგიამის სახეობები DS– ების უფრო დიდი რაოდენობით ( = 4, 12, და 48). 1DS სტრუქტურის მსგავსად, ჩვენ მოვამზადეთ სამი ნიმუში დნმ-ორგიამის სახეობებზე = 5, 10 და 20 ნმ და გაზომეს თითოეული ნიმუში ჯერ დაბალი ლაზერული ენერგიით. უშუალოდ თითოეული დაბალი ენერგიის გაზომვის შემდეგ, ჩვენ გადავიღეთ იგივე FOV მაღალი ლაზერული ენერგიით, რათა მიიღოთ ვიზუალური ცნობარი მაღალი რეზოლუციით, რომელსაც ენიჭება თითოეული ლოკალიზაციის მტევანი დაბალი სიმძლავრის გაზომვიდან. 4d– ის ზედა პანელი ასახავს = 4 დნმ – ის ორგამის დიზაინი, მაგალითად, ერთიანი სტრუქტურის დნმ – სურათის სურათი, რომელიც შეიძინა დაბალი ლაზერული ენერგიით (მარცხნივ) და შესაბამისი მაღალი სიმძლავრის მქონე გამოსახულებით, რომელიც ასახავს ოთხ DS– ს შემუშავებულ ნიმუშიში (მარჯვნივ). შემდგომში ჩვენ გამოვიყენეთ ლაქის გამოვლენის ალგორითმი მაღალი სიმძლავრის სურათზე, რათა ავტომატურად გამოვთვალოთ დღევანდელი DS- ების რაოდენობა, როგორც საფუძველი ჭეშმარიტებისა lbFCS და qPAINT შედეგებისგან, დაბალი ლაზერული დენის სურათებისგან ეფექტურობა, რომლითაც ინდივიდუალური საკეტების ძაფები გაერთიანებულია თითოეულ დნმ-ის ორგამში, დასაკეცი პროცესის დროს, შეზღუდულია და ასევე დამოკიდებულია პოზიციაზე, (39), ანუ მხოლოდ ძალიან ცოტა სტრუქტურას აქვს ყველა DS საწყისი საწყისი დიზაინისგან. ფიგურა 4d- ში ქვედა პანელი გვიჩვენებს lbFCS (ლურჯი) და qPAINT (წითელი) დაბალი ენერგიის გაზომვებიდან, აგრეთვე ვიზუალური დათვლის შედეგები (ნაცრისფერი) მაღალი დონის გაზომვებიდან სამივე ნიმუშისთვის. = 4 სტრუქტურა. ამ დნმ-ის ორიგამის დიზაინის დასაკეტამ შედეგად სტრუქტურებმა პირველ რიგში გამოავლინა ერთი ან ორი DS, რომელთა ნახვა შესაძლებელია გარკვეულ მწვერვალებში ყველა lbFCS განაწილებაში და რაც მხედველობაშია ვიზუალურ მითითებასთან (იხილეთ დამატებითი სურათი 11 ა) შედარების მიზნით. lbFCS / qPAINT შესრულება ვიზუალური შემოწმების ინდივიდუალურ ინტეგრებთან მიმართებაში). ასევე qPAINT იძლევა განაწილებას, რომელიც მოიცავს lbFCS და ვიზუალურ შედეგებს, თუნდაც ნიმუშზე გამოსახული = 20 ნმ (როგორც მოსალოდნელია სურათი 4 ბ – დან რეჟიმისთვის) სურათი 4e ასახავს გაზომვის შედეგებს გაზომვის სერიის შესახებ = 12 სტრუქტურა. კვლავ lbFCS აწარმოებს დათვლის შედეგებს, რომლებიც კარგად არის დაკავშირებული ვიზუალური დათვლის მითითებასთან (იხ. დამატებითი სურათი 11b ვიზუალური შემოწმებისას სრულყოფილი შედარებისთვის), ორივე გარშემო აღწევს 10 და ორივე განაწილებულია ერთნაირი განაწილების ფორმით. ამასთან, qPAINT– ისთვის ჩვენ ოდნავ მარცხენა გადანაწილებული განაწილება მივიღეთ თუნდაც ნიმუშზე გამოსახული ნიმუშისთვის = 5 ნმ, რაც კიდევ უფრო გაიზარდა და გაფართოვდა = 10 და 20 ნმ ნიმუშები. როგორც ნახატი 4 ბ – დანა მოსალოდნელი, ამ ნიმუშებიდან ამოღებული ინტენსივობის კვალი დაიწყო QPAINT– ის ანალიზისთვის საკმარისი უნიკალური ბნელი დრო (შეადარეთ დამატებითი ნახაზები 7 და 9. დანახარჯების ანალიზური მტევნების მთლიანი რაოდენობა, რომლებიც მოცემულია ნახ .4d – f– დან თითოეულ მონაცემში) მოცემულია დამატებითი ცხრილი. 1). დაბოლოს, ჩვენ ვნახეთ ნიმუშების სერია, რომელიც შეიცავს = 48 სტრუქტურა (სურათი 4f). როგორც ვხედავთ ზედა პანელში, ჩვენ შეგვიძლია ნაწილობრივ გადავწყვიტეთ DS– ის მჭიდროდ შეფუთული დნმ – საღებავების 10 ნმ მანძილზე დაშორება. ამასთან, სივრცითი რეზოლუცია არ აღმოჩნდა საკმარისი იმისათვის, რომ მოხდეს ადგილზე აღმოჩენის ალგორითმი, რომელიც ადრე გამოიყენებოდა = 4 და = 12 origami მიუკერძოებელი ვიზუალური საფუძვლის სიმართლისათვის. DS ინკორპორაციის ეფექტურობა იწვევს დნმ-ის origami- ის სტრუქტურებში DS- ების რეალურ რიცხვში ფართო გავრცელებას , რომელიც თანხმდება lbFCS მიერ დათვლილი DS– ების განაწილების გაფართოებასთან შედარებით, ვიდრე დნმ – ის ორიგინალთან შედარებით, ნაკლები DS– ით. ამასთან, სამივე გამოსახულების კონცენტრაციისთვის lbFCS- მა აჩვენა იგივე დათვლის შედეგები, რომლის გარშემოც მედიანაა ≈ 25. თუმცა = 5 ნმ – ს ნიმუში qPAINT შედეგები შედარებით კარგადაა შეთანხმებული lbFCS– სთან, განაწილება ხდება 10 ნმ – ის ნიმუშისთვის და კვლავ გადადის მარცხნივ იმის გამო, რომ არ არსებობს უნიკალური ბნელი დრო, რომელიც ამოღებულია შესაბამისი ინტენსივობისგან და დროის კვალიდან. როგორც მოსალოდნელია სურათი 4 ბ – დან = 20 ნმ, დნმ-ის ორგამიის დიზაინის DS სიმკვრივე უკვე აღემატება qPAINT მოქმედი ზღვარს, რადგან ყველა მტევნის თითქმის 75% -ს აღარ აჩვენა ერთი ბნელი დრო (იხ. დამატებითი ცხრილი 1).
დაბოლოს, ჩვენ გამოვიკვლიეთ, შესაძლებელია თუ არა დაბალი ლაზერული ენერგიის გაზომვების დროს აგრეთვე შეინიშნება რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (ROS) მეშვეობით ფოტომინირებული გამოწვეული DS დაქვეითება, რაც წარმოიქმნება საღებავის მოლეკულების აგზნების საფუძველზე, როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი Blumhardt et al. (26). = 12 სტრუქტურა, ჩვენ გავიმეორეთ კონცენტრაციის სერია ახალი ნიმუშებით, ამჯერად გაზომვისას ოთხჯერ აღემატებოდა ჩვეულებრივ დაბალი ენერგიის გაზომვას ჟანგბადის დახვევისა და სამმაგი მდგომარეობის ჩაქრობის სისტემის გამოყენების გარეშე (4 × 30 წთ). ამის შემდეგ ჩვენ დროებით გადავფორმეთ საერთო მონაცემები ოთხ ქვესათაურად და თითოეული ქვესათაური ინდივიდუალურად გავაანალიზეთ lbFCS– ის საშუალებით. დამატებითი სურათი 12 ა ასახავს შედეგს ⟨τ⟩ წინააღმდეგ ყველა სეგმენტის დამოკიდებულება. ჩვენ ვერ დავინახეთ მნიშვნელოვანი განსხვავება დროის სეგმენტებს შორის, რაც მიგვითითებს იმაზე, რომ ჰიბრიდიზაციის მაჩვენებლები არ იყო დაზარალებული და პირდაპირ მტკიცებულებას ვაძლევთ, რომ არ არსებობს გამოსახულების ხსნარის გაუფერულება (ე.ი. შემცირება ) 2 საათის განმავლობაში გაზომვის დროს. ამის გათვალისწინებით, აშკარა ცვლილებაა 1 / წინააღმდეგ როგორც ეს მოცემულია დანამატის გრაფიკაში 12 ბ არის პირდაპირი შედეგი DS– ების დაქვეითების შედეგად, რაც იწვევს შემცირებას (შეადარეთ eq 1). დამატებითი გრაფიკი 12c აჩვენებს დათვლის შედეგებს ყველა სეგმენტზე, რომლებიც ნორმალიზდება პირველი სეგმენტის მნიშვნელობამდე, თითოეული კონცენტრაციისთვის. 20 ნმ-იანი გამოსახულების კონცენტრაციისთვის, DS- ების 20% -ზე მეტი ამოიწურა 2 გაზომვის შემდეგ. გარდა ამისა, დაფიქსირდა შემცირების სიჩქარის ზრდა გამოსახულების კონცენტრაციის გაზრდასთან, რაც ეთანხმება წინა შედეგებს, რაც გვიჩვენებს, რომ ფოტოპროდუქციის შედეგად გამოწვეული დაზიანების მასშტაბებს DS ოკუპაციასთან. (26) დამატებითი ნახაზის 12 ბ-ის შედეგებთან დაკავშირებით, ეს დამატებით განმარტავს რატომ არის ოფსეტური 1 / აშკარა ხდება შემდგომ სეგმენტებისთვის, რადგან 1 / სხვადასხვა კონცენტრაციების ღირებულებები უკვე წარმოიშვა სხვადასხვა ნაწილისგან შემცირების სხვადასხვა მაჩვენებლის გამო.
One of the proposed strategies to circumvent DS depletion is the use of oxygen scavenging systems such as pyranose oxidase, catalase, and glucose (POC) to directly remove ROS from the solution upon generation.(26) We repeated the same extended low power measurement series with POC and Trolox (a commonly used triplet state quencher) added to the imaging buffer. Subsequent lbFCS analysis revealed neither changes in ⟨τ⟩ nor in 1/A over the four time segments (Supplementary Figure 12d,e). Hence, usage of oxygen scavenging systems allows one to virtually eliminate DS depletion during the low laser power measurements for lbFCS (Supplementary Figure 12e,f).
In conclusion, we presented lbFCS as an absolute counting approach for DNA-PAINT microscopy in a proof-of-principle study targeting DNA origami structures as ideal samples. On the basis of imaging a target of interest at several imager concentrations, we showed that lbFCS allows the extraction of imager hybridization rates at high precision from target clusters independent of the number of DSs within a cluster, which subsequently serves as calibration for counting of DS numbers within all clusters. We first confirmed the measurement principle on DNA origami exhibiting only a single DS and assayed the measurement uncertainty and the influence of experimental conditions such as temperature and buffer ion concentration. Next, we examined the performance of lbFCS to count the increasing number of DSs per cluster and compared the obtained results to the state-of-the-art DNA-PAINT counting approach qPAINT. We first increased the cluster size in a controlled way by grouping experimentally obtained clusters containing only a single DS into clusters of defined N. The obtained results show that lbFCS yields the correct counts over a range of more than 40 DSs for various imager concentrations in contrast to qPAINT. In addition, the extracted hybridization rates were unaffected by the number of DSs per cluster within the measurement uncertainty. Subsequent experimental benchmarking of lbFCS on DNA origami structures exhibiting multiple DSs yielded counts in good agreement with the visual ground truth obtained from high-resolution images from the respective FOVs. Finally, we could confirm previous results regarding the depletion of DSs in DNA-PAINT.(26) lbFCS is sensitive enough to detect slight changes in N due to depleted DSs and gave direct evidence that neither the hybridization rates nor the “effective” imager concentrations were affected by the employed low laser intensities during image acquisition. The usage of oxygen scavenging systems helped to virtually eliminate the depletion of DSs, underlining the applicability of our approach.

The work presented in this study was based on surface-immobilized DNA origami structures as model targets for DNA-PAINT microscopy. It should be highlighted that in this case all presented counting results here could also be obtained correctly via qPAINT when the imager concentration is adjusted according to the DS density. qPAINT could in principle also deal with samples containing heterogeneous cluster densities by imaging the sample at different imager concentrations. We particularly see the strength of lbFCS in future applications to DNA-PAINT data of biological samples, where it might be hard to identify enough single DSs for a robust calibration of the qPAINT influx rate. Additionally, local factors such as charge differences or steric hindrance effects introduced, for example, by the labeling linker to the target molecule, might lead to changes in the imager association rate limiting the applicability of the calibration rate obtained from DSs on DNA origami. While lbFCS could potentially solve these problems, the way toward cellular samples bears several difficulties that still remain to be tested. These include, among others, the effects of elevated background fluorescence, robust cluster identification and demands on achievable spatial resolution. We further would like to point out that lbFCS in its current state relies on the identification of spatially well-separated clusters and is hence not applicable to continuous structures (e.g., filaments).

Despite the focus on molecular counting presented here, the scope of lbFCS essentially exceeds the study of specific DNA–DNA interactions as in DNA-PAINT. We see promising applications translating the high precision of lbFCS to study specific and reversible DNA–protein and protein–protein interactions with one of the species immobilized on a surface. In addition, lbFCS could also find application in structural in vitro studies to count subunits of immobilized multimeric complexes.

When targeting fixed cells, however, future work needs to address possible local changes in DNA hybridization rates, which might lead to large deviations between DSs and clusters. A next step in this direction will be combining lbFCS with Exchange-PAINT(40) in order to acquire the imager concentration series at the same FOV of a sample, potentially providing access to local changes in hybridization rates and allowing direct calibration with the cluster-specific rates for more robust counting. Finally, the same FOV would be imaged at high laser intensity for obtaining a DNA-PAINT image at highest spatial resolution. Complementing high-resolution DNA-PAINT images with an additional layer of robust quantitative information obtained via lbFCS has the potential to move the technology away from artificial or well-studied structures toward physiologically relevant targets and, ultimately, biological discovery.