Electrochemical discovery of tumor-derived cellular vesicles on nanodigested electrodes.

Sandwich immunoassay on nanosilk interdigitated electrodes

An illustration of our detection principle is shown in Figure 1. To achieve an amplification level that is sufficiently strong to deliver tdEVs at physiologically relevant concentrations, we use a two-level amplification strategy: (i) First enzymatic amplification using alkaline phosphatase (ALP), to release electroactively , Followed by (ii) Amplification of the electrical signal through electrochemical redox cycles on nanoscale interdigitated electrodes (NIDEs). Given the complexity of the targeted biological sample, sophisticated selectivity is required to obtain a signal that is only present on tumor-derived species, i.e. With low background signal. Here, sandwich immunoassay with tumor-specific antibodies is provided, which provides two levels of selectivity. The assay contains an anti-EpCAM (C-AE) antibody that captures tdEVs and a reporter antibody (anti-EpCAM, R-AE) in ALP, with biotin-streptavidin interactions. Here, the same antibody clone is used for two steps of the immune-prone assay, VU1D9, which is an anti-EpCAM clone that is proven to be stable and highly susceptible to EpCAM (K.D ∼ 2.7 × 10–10 L). (32) The conduction of C-AE electrodes on the electron compartment comprises three steps. First, the amino-terminated thiol (amino-unecane, AUT) self-assembled on the Pt electrodes. Second, the amine reactive bifunctional poly (ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDGE) reacts with the AUT layer, adding an antifusion bond layer. Subsequently, the C-AE antibody is covalently bound, with moderate to slightly basic pH (8.3) and high ionic strength (2 M sodium phosphate). (33) This C-AE enables specific capture of tdEVs obtained by EpCAM expression. Human prostate adenocarcinoma cell lines (LNCaP) and, as such, provide the first level of selectivity. Upon their capture, tdEVs interact with the biotinylated reporter anti-EpCAM antibody (R-AE) to provide second-level selectivity, as anti-cancer EVs (e.g., blood cell production) would not be recognized by either C-AEs or R -AEs. Use of the same antibody clone at both stages of the immunodeficiency may result in partial degradation of the antibody / antigen complex formed between C-AE and EV to form a new antibody / antigen complex with R-AE, thereby releasing EV. From the surface. The use of a distinct pair of antibodies as C-AE and R-AE (e.g., VU1D9 and HO-3) would be more advantageous in this context. However, given that it may be near-undesirable for R-AE to approach the C-AE / antigen complex, and because each EV must be captured by multiple antigen / antibody interactions, it is highly unlikely that the EVs will release immune suppressants. In the second stage. . The biotic half of R-AE interacts with streptavidin-conjugated alkaline phosphatase (SAV-ALP). ALP is known for its ability to bind to substrates containing phosphate groups. Here the substrate (para-aminophenyl phosphate, pAPP) is chosen since its unopened form is electrochemically inert, and its wrapped form, paramininophenol (PAP), is electrochemically active (34). This enzymatic reaction provides the first enhancing mechanism. In electrochemical measurements, one of the NIDE working electrodes is stored at the PAP reduction potential (above the official potential), and the second working electrode is purified at a lower potential than its official potential. At the anode, pAP is oxidized to a paradoxone imine (pQI) that extends to the cathode. At the cathode, pQI decreases in pAP. The electrochemical reaction can be denoted as pAP ⇆ pQI + 2E. Since the gaps between the NIDE electrodes are small (120 nm), the pAP and pQI molecules flow continuously and efficiently through diffusion between the two working electrodes, producing a steady state that directly magnifies the tdEV concentration. This redox cycle provides the second level of amplification.

Figure 1

Figure 1. Schematic illustration of tdEV sensors using a Dutch sandwich immunoassay and redox bicycle, resulting in two levels of selection and two levels of amplification. tdEVs are abducted by C-AE using electrodes (first level of selection). Binding of R-AE to tdEVs results in an antibody – antigen – antibody sandwich (second level selectivity), after which the enzyme ALP is introduced by biotin – SAV interaction. ALP provides enzymatic enhancement of pAPP by substrate cleavage (first level amplification) followed by amplification of the electrochemical signal by oxidation from pAP to PQI and subsequent redox cycling between NIDE electrodes (second level amplification).

tdEV investigation on networks

tdEVs were prepared following the protocols described in SI-2. In short, tdEVs were isolated from LNCaP cells cultured in serum-free medium. TdEV samples were first characterized by using nanoparticle tracking (NTA) to measure the concentration of tdEV (i.e., 106/ µL). Surface functionalization of electrodes and tdEV capture steps were evaluated using AFM. The AFM images acquired on the functionalized non-patented (plain) Pt surface are shown in Fig. SI-2 (see supporting information). EV capture was then tested using AFM on NIDE devices. LNCaP-derived tdEVs (25 μL, concentration 10)6 EVs / μL, as prescribed by NTA), were incubated on the C-AE functionalized electrode surface. As shown in Fig. 2, depicting AFM images on T-AE functionalized electrodes prior to the capture and reception of tdEVs, circular objects were found on the electrodes with an approximate diameter of 30–150 nm. These objects correspond to relatively small EVs (26), which are less susceptible to shear forces when microchannel insertion is used to remove unlimited species, as Stokes emphasizes linear scales with object size (while ignoring viscous deformation or size-dependence). The system was not purposely designed to eliminate tdEVs further, as EVs captured on networks do not expect short circuiting of the electrodes due to their dielectric properties. It may be that the tdEVs seize the space between the electrodes, which is not replaced by an antifusion layer and antibodies. These objects can be captured by antigen / antibody interactions with antibodies present on the electrode pavements. Alternatively, some tdEVs may not be specifically bound to the surface. The presence of these latter EVs does not affect the results of the measurements, which directly depend on the interaction with the second antibody (second level of selection).

Figure 2

Figure 2. Atomic force microscope height images: (a) bare electrodes before chemical modification and (b) modification and capture of EpCAM-positive tdEVs obtained from LnCAP cell lines. Captured objects are 30–150 nm in diameter, which is good for small EVs (scale bar: 200 nm).

Following confirmation of surface chemistry on aircraft substrates (see SI-4), the same functionalization protocol was applied to NIDEs prior to electrochemical measurements. 100 µL of PBS tdEV solution was injected into the microfluidic channel, and this solution was repeatedly incubated several times and for 90 minutes during incubation. Different concentrations in EV (initially 106 EVs per μL) were tested for the concentration dependence of our nanosensor and associated sensor probe. Thereafter, pour the microcannel with PBS solution to remove adsorbed particles specifically on the electrodes. Accordingly, IDEs were incubated with biotinylated R-AE (10 μL, 25 mg / ml in PBS, 30 min incubation) and washed with PBS. Subsequently, SAV-ALP (10 μL, 10 U solution in PBS, 30 min incubation) was then introduced into R – AE to interact with biotin. Next, IDEs were washed with PBS and incubated with pAPP solution (100 μL, 10 mM PBS, 45 min incubation), prior to electrochemical measurements. It should be noted that although the activity of ALP is optimal under alkaline conditions, physiological pH is favored by EVs. Accordingly, the ALP incubation step was performed at room temperature in PBS (pH 7.4) without active temperature control. Negative control measurements were performed on platelet-derived EV (pdEV) 108 pdEVs / μL that are not EpCAM positive and do not interact with Epicam antibodies (both C-AE and R-AE). Finally, to evaluate the sensitivity provided by the nanoscopic electrodes and thus to obtain sensitivity, we compared their performance with microcurrent IDEs (μIDEs) that are 3 μm wide, 70 nm high, and 3 μm apart. The height of the electrode sutures and total sensory area were the same for both devices, to facilitate performance comparisons.
A schematic representation of the measurement parameter is shown in Fig. 3a; It includes two sets of independent working electrodes (WE-1 and WE-2) and an external / AgCl reference electrode (RE). For WE-2, a fixed potential (.10.1 f) was used with respect to RE. Since the RE current is very low, the stability of the RE was not compromised, even when no additional counter electrode (CE) was available. Therefore, the CE terminal of the potential mast was associated with RE. Volumetric responses of NIDs (scan speed 50 mV / sec) were first observed after different steps of functionalization, i.e. (1) after C-AE functionalization, (2) after tdEV capture, (2) after T -EV capture, ( (3) after R-AE immobilization, and (4) biotinylated R-AE on SAV-ALP and subsequent washing, as well as in the presence of pdEVs (pdEVs) (negative control) .

Figure 3

Figure 3. Cyclic voltograms of tdEVs on networks: Assessment of device specificity. (A) Schematic representation of electrochemical measurements. Cyclic voltammograms (CV) recorded (b) after various steps of NIDs functionalization, after C-AE surface modification (green), after tdEV capture (brown), and after sandwich formation R-AE (blue), etc. . (c) in the presence of tdEVs in the nIDEs (brown) and in the μIDE (green), or in the presence of pdEVs in the networks (magnata). The background signal (blue) corresponds to the device after the generation of the antibody sandwich. Flows IAnode (Solid lines) and ICathodic (Dashed lines) were measured in anode and cathode set in electrodes / nodes / frames, respectively. CV was acquired for 1 mM pAPP solution in PBS (pH 7.4) at −0.1 V and +0.6 V against Ag / AgCl at a scan time of 50 mV.

Figure 3b presents typical types of cyclic voltammograms obtained after various surface functionalization steps prior to the application of ALP. In all three cases discussed here, no significant change in the recorded current was observed when pAPP was added to the solution, and a maximum current of 262 pA was observed at 0.6 V at Ag / AgCl after R-AE addition. Since pAPP is electrochemically inactive, no redox activity is observed, as mentioned herein. It should be noted that the recorded voltammograms are similar I/F Characteristics of the RC series circuit, capacitive charging and charging with voltage robbery and hysteresis. In addition, a maximum amplitude change of 0.6 V at Ag / AgCl was observed after each surface operation. კერძოდ, მნიშვნელოვანი capacitive ცვლილება დაფიქსირდა tdEV- ების იმობილიზაციის შემდეგ, რაც შეიძლება შეინიშნოს მაქსიმალური მიმდინარე მნიშვნელობის ცვლილებით (0.6 ვ-ს წინააღმდეგ Ag / AgCl) 125.1 ± 6.5 pA- დან 245.1 ± 28.3 pA- ს შემდეგ იმობილიზაცია. მიუხედავად იმისა, რომ სენდვიჩის შესამოწმებლად R-AE– ით სენდვიჩის შემსწავლელი ფორმის შეცვლა, შესამჩნევია, იგი შედარებით დაბალია, ვიდრე წინა ზედაპირული ფუნქციონალიზაციის ნაბიჯთან შედარებით 10-ით.6tdEVs / μL (245.1 ± 28.3 pA– დან 267.6 ± 15 pA). ეს ქცევა შეიძლება მიუთითებდეს ძარცვაზე დატენვის დროს ვეზიკულებში. უარყოფითი კონტროლის მქონე ნიმუშზე (10-ით)8pdEVs / μL), როგორც ქვემოთ განვიხილეთ, ტევადობის ცვლილება არ შეინიშნებოდა, რაც ამ არგუმენტს ამტკიცებს. ჩვენს პოზიტიურ და უარყოფით საკონტროლო ნიმუშებზე ჩაწერილი სიგნალებს შორის განსხვავება ასევე იმაზე მიუთითებს, რომ ანტიფუჟირების ფენა მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ჩვენს მოწყობილობაში და ასრულებს ისე, როგორც მოსალოდნელი იყო.
შემდეგ ეტაპზე, ჩვენ შევადარეთ NIDE- ების და μIDE- ების პასუხი, მსგავსი პირობების გამოყენებით, როგორც ადრე (10 μL, 106 tdEVs / μL, 1 mM pAPP in PBS (pH 7.4), სკანირების სიჩქარე 50 მვ / წმ), SAV-ALP– ის დანერგვის შემდეგ. დიაგრამა 3c წარმოგიდგენთ დიფუზიურად შეზღუდული რედოქსული ველოსიპედის დინების დამახასიათებელ სიგმოიდურ მრუდებს მჭიდროდ დაშორებულ სამუშაო ელექტროდებზე. NIDE- ების შეზღუდვის დენი იზრდება ელექტროდებს შორის უფსკრული ზომის შემცირებით. ამიტომ, მიუხედავად იმისა, რომ NIDE- ების და μIDE- ების მთლიანი სენსორული ზედაპირი იგივე იყო, μΙ– ს შორის 3 – იანი უფსკრული შედეგი გამოიღო მკვეთრად უფრო დაბალი შემზღუდავი დენის (1.53 ± 0.01 ნ.ა) შედარებით ნიდერტებთან შედარებით, რომლებიც გამოყოფილი იყო 120 ნმ-ით ( 11.76 ± 0.04 ნ.ა). გარდა ამისა, μIDE– ების კოლექტორის ეფექტურობა (კათოდო – ანოდის შემზღუდავი დენების თანაფარდობა) აღმოჩნდა მხოლოდ 62.3%, NID– ებისთვის 99,8% -თან შედარებით. ეს მნიშვნელოვანი განსხვავება იმაზე მეტყველებს, რომ რედოქსის შუამავლის მოლეკულები უფრო მეტჯერ ციკლდება ანოდს და კათოდს μID- ებს შორის, სანამ ნაყარი ხსნარში გავრცელდება. საერთო ჯამში, ნანოსკოპის ელექტროდებმა უზრუნველყეს სიგნალის times8-ჯერ უფრო დიდი ამპლიფიკაცია, ვიდრე მათი მიკროსქემის კოლეგებთან შედარებით.
შემდეგი, ჩვენ გამოვიკვლიეთ ჩვენი მოწყობილობის სპეციფიკა tdEV– ების დაჭერისა და ანალიზისთვის (სურათი 3c). tdEVs და pdEV ნიმუშები გაანალიზეს იმავე პირობებში, როგორც ადრე. ჩვენ შევადარეთ პასუხი (1) tdEV + R-AE (ლურჯი მრუდი), მაგრამ სანამ ინკუბაცია SAV-ALP- ით მოხდა nIDEes- ზე, (2) pdEV nIDEes- ზე (მაგგენის მრუდი), (3) tdEV nIDEes- ზე (ყავისფერი მრუდი) , და (4) tdEV μIDEs– ზე (მწვანე მრუდი), გამოსაცდელი ყველა საჭირო რეაგენტის შემოღების შემდეგ. Capacitive მიმდინარე (267.6 ± 15 pA) ჩაწერილი tdEV + R-AE ნიმუშისთვის (106 ნაწილაკები / μL) უფრო მაღალია ვიდრე pdEV ნიმუშისთვის (170.1 ± 13.2 pA) 0.6 V- ზე ∼108 ნაწილაკები / μL. უფრო მეტიც, შეზღუდვის დენის შედარებისას დაფიქსირდა სიგნალის times60-ჯერ გამაძლიერებელი ნიშანი საკონტროლო ნიმუშთან შედარებით pdEV– სთან NIDE მოწყობილობებისთვის (მაგგენას მრუდი). ისევ და ბოლოს, ეს შედეგები კოლექტიურად მიგვითითებს, რომ tdEVs სპეციალურად არის აღბეჭდილი ელექტროდის ზედაპირზე, ხოლო pdEV– ები არ არიან, რაც ასახავს ნანოსენსორის სპეციფიკას.
როგორც შემდეგი ნაბიჯი, შეფასდა გამოკვლევის მგრძნობელობა და დინამიური დიაპაზონი, საწყისი tdEV– ის ნიმუშის სერიული განზავებით სამ სხვადასხვა მოწყობილობაზე ( = 3). თითოეული მოწყობილობისთვის და თითოეული კონცენტრაციისთვის, CV გაზომვები ჩატარდა, როგორც ადრე, 1 მმ pAPP PBS ბუფერში pH 7,4-ში, სკანირების სიჩქარით 50 mV / s. ეს ჩანაწერი სამჯერ განმეორდა 5 წუთიანი ინტერვალით, გაზომვების სტაბილურობის დასადგენად. TdEV კონცენტრაციის ცვლის შემდეგ დაფიქსირდა CV– ები 10 – დან 10 – მდე6 EV ανά μL წარმოდგენილია ნახაზში 4 ა, სადაც ნაჩვენებია tdEV კონცენტრაციის მნიშვნელოვანი გავლენა. სამი დამოუკიდებელი მოწყობილობის გამოყენებით დაფიქსირებული ამ მონაცემებიდან დადგინდა კალიბრაციის მრუდი (სურათი 4 ბ) შემზღუდავი დენის გამოყენებით 0.6 V- ზე, გამოვლენილია შესანიშნავი ხაზოვანი დინამიური დიაპაზონი, რომელიც მოიცავს მასშტაბის მინიმუმ 6 ბრძანებას და წარმატებული გაზომვები მინიმუმ 10 tdEVs / μL- მდე, ფონური სიგნალისგან გამორჩეული მკითხველით. ამ კალიბრაციის მრუდის ფერდობზე ექსპოპოლიზაციით, ჩვენი გამოსაცდელი მიმდინარე LOD შეფასდა დაახლოებით. 5 tdEVs / μL.

სურათი 4

სურათი 4. გამოკვლევის მგრძნობელობა და დინამიური დიაპაზონი tdEV– ების გამოსავლენად. (ა) ანოდიის ციკლური ვოლტამოგრამები, რომლებიც ჩაწერილი აქვთ ანოდში tdEV ნიმუშებისთვის, კონცენტრაციით 10-დან 10-მდე.6 tdEVs თითო μL. (ბ) ასოცირებული კალიბრაციის მრუდი (საფუძველზე დამყარებული დენებისაგან, რომლებიც ჩაწერილია 0.6 V– ით Ag / AgCl– ის წინააღმდეგ), რომელიც ავლენს დინამიურ დიაპაზონს, რომელიც მოიცავს მასშტაბის მინიმუმ 6 ბრძანებას (მოწყობილობების რაოდენობა, = 3). ჰორიზონტალური წერტილოვანი ხაზით გამოსახულია ფონის დონე, პლუს რედოქსული დენის სტანდარტული გადახრა (SD); ამ ჰორიზონტალური ხაზისა და კალიბრაციის მრუდიდან ჩანს თეორიული LOD როგორც მინიმუმ 5 tdEVs / μL. (პირობები: 1 მმ pAPP ხსნარი PBS (pH 7.4); სკანირების სიჩქარე 50 მვ / წმ.)